关节内上下骨端覆盖着一层光滑而富有弹性的关节软骨（ , AC ），钙化软骨层（ zone , CCZ ）位于骨与软骨之间，三者共同构成关节软骨单位[]。 关节软骨内没有血管和淋巴管，细胞密度很低，自我修复能力很弱。 外伤或疾病后，常发展为整个骨软骨单位的病变——关节骨软骨缺损。 临床上各种损伤引起的关节骨软骨缺损十分常见，关节镜手术检出率可达19.2%[]； 骨关节炎的退变最终发展为重症骨关节炎，严重影响患者的身心健康和生活质量，同时给社会和家庭带来巨大的经济负担。
目前临床治疗关节骨软骨缺损的方法有非手术治疗及关节清创术、微骨折术、自体骨软骨移植或马赛克马赛克整形手术、自体软骨细胞移植（ACI）和基质诱导的自体软骨细胞移植（MACI）等手术治疗[]，但远期疗效不理想。 其中，微骨折后的缺损修复组织为纤维软骨，其力学性能和润滑性能与透明软骨有较大差异[]； 自体骨软骨移植与ACI手术治疗类似拆东补西，移植物或移植细胞来源有限，对于缺损面积大于4cm2或以上患者疗效不理想超过 35 岁[]。
组织工程的技术策略旨在通过复合种子细胞、生长因子和组织支架来再生和修复受损组织的结构和功能。 关节软骨的组成比较简单，结构比较简单，没有复杂的血管系统。 其组织工程实施难度相对较大，被认为是治疗关节骨软骨缺损最有前景的技术方案。 20世纪90年代以来，关节软骨与骨组织工程的研究取得了很大进展，但同时也存在组织过度纤维化、移植物下沉、成骨异常、软骨过度生长、支架分离等不足[]。 与天然关节骨软骨组织相比，单层或双层支架缺少软骨与骨之间的“界面结构”——钙化软骨层[，导致关节软骨和软骨下骨（bone，SB）各自的显微结构。 环境稳态的失衡和应力传导方式的改变最终导致其修复结果失效。 为了实现其完全仿生，研究人员尝试了多种方案来构建具有界面层结构的多层关节骨软骨支架。 近年来，随着新工业革命增材制造技术的兴起，3D打印技术得到快速发展，为解决这一问题提供了新的工具和技术方法，相关研究取得了重大进展。 本文将从关节骨软骨单元的组成和结构功能、构建其界面层结构的必要性、3D打印技术方案、构建效率对比等方面对界面层3D打印技术框架进行综述单层和多层支架。 结构性关节骨软骨多层支架的科学意义、技术方法及未来展望。
1 关节骨软骨单位的组成及结构与功能
人体关节骨软骨单位组织由三部分组成，即关节软骨（AC）、软骨下骨（SB）和它们之间的边界层结构——钙化软骨层（CCZ），其组织组成、纤维排列、细胞群落和力学性能不同。 其中，AC和SB的物理、化学和生物学特性已有多项研究报道，而CCZ的解剖位置特殊且相对隐蔽，其研究的技术手段有限，是研究的难点。关节骨软骨单元研究领域。
CCZ是一种天然的界面结构，是成熟滑膜关节中位于AC和SB之间的一层钙化软骨组织[]。 相关研究结果表明，CCZ形状致密，以“齿梳”状铆接在SB上，厚度为（104.16±20.87）μm，主要干物质成分为Ⅱ型胶原（20.16±0.96） %，羟基磷灰石（65.09±2.31）%[-]，压缩弹性模量为（208.6±39.7）MPa，拉伸弹性模量为（178.3±35.9）MPa，比透明软骨硬10倍，是骨的1/60硬度[ ]。 这种特殊的形状和成分赋予了CCZ独特的力学性能，使得运动过程中关节的机械冲击在CCZ处得到显着衰减。 更重要的是，CCZ可以将关节软骨的剪切力转化为压缩应力传递给SB，从而大大降低关节软骨被压碎和撕裂的可能性。
CCZ除了具有独特的机械功能外，还起到重要的屏障作用。 关节软骨与软骨下骨之间的物质交换是被CCZ完全阻断，还是存在部分物质交换，一直存在争议，多数学者认为CCZ的存在导致关节软骨与软骨下骨相互作用。 物质交换非常困难[-]。 体内成熟/未成熟小鼠CCZ通透性的原位观察研究表明，无论是罗丹明B（476）还是荧光标记的葡聚糖（20×103），成熟小鼠的CCZ对两种荧光示踪剂均具有阻断作用（以潮汐线为界），但未成年小鼠的CCZ无此阻断作用[]。 CCZ屏障功能的改变对关节软骨的发育形成和软骨正常生理功能的维持具有重要作用，但其具体机制尚未阐明。 此外，天然CCZ骨软骨支架修复潇湘猪膝关节骨软骨缺损的实验研究发现，与未使用天然CCZ骨软骨支架的组相比，天然CCZ骨软骨支架取得了优异的再生修复效果[]。 该结果表明在关节骨软骨缺损的再生修复中重建CCZ结构的必要性。
综上所述，CCZ是介于关节软骨和软骨下骨之间的特殊过渡结构。 它以其独特的方式将体内两个在化学成分、机械作用和生物学性能方面完全不同的组织联系起来。 性对于维持关节骨软骨的生理微环境和生理功能至关重要。 因此，在设计和制造关节骨软骨复合组织支架时，需要考虑包括CCZ在内的构建技术和方法。
2 3D打印建造技术
在天然人体组织中，关节软骨的多糖链之间的孔径约为6 nm，胶原纤维网络的孔径为60~200 nm，并垂直延伸至CCZ[]。 与AC不同，CCZ和SB的内部结构更为致密，关节骨软骨组织单元是一个有序连接的整体。 这是一个很大的挑战，尤其是如何考虑其施工原材料的选择和施工的技术方案。 目前，最常用的通过3D打印构建关节骨软骨复合组织工程支架的技术包括：材料挤压（ , ME ）、熔融电写（ melt - , MEW ）、静电纺丝（ - , ES ）、光固化（ , SLA ）和数字光处理（光，DLP）。
2.1 材料挤压技术
材料挤出 (ME) 技术通过喷嘴移动材料，将其沉积在 XY 平面上的打印床上，然后在 Z 平面上逐层堆积。 因此，在标准 ME 打印中，所有沉积材料都需要（至少部分）在底层的支撑材料或支撑槽上堆积[]。
ME 打印技术允许使用多种材料，包括热聚合物、水凝胶和生物陶瓷，其中每种类型的打印材料或复合材料都需要微调打印参数，例如温度、挤出压力、打印速度、水凝胶速度交联或胶凝 [-]。 ME的优势在于它可以创建一个相对多孔的高孔隙率支架，使种子细胞容易粘附和增殖并长成组织。 研究表明，孔径较小（<0.1 mm）的支架可以帮助新软骨的形成，而孔径较大（>0.3 mm）的支架可以促进成骨细胞的生长[]。
基于热聚合物的 ME 技术可以打印出与 SB 最相似的多孔结构。 在异质骨软骨支架的SB部分，其孔径通常为0.3~1.0 mm，孔隙率为70%~80%[-]。 使用热聚合物基材料调整支架的孔隙率范围和孔径可以促进骨生长，非常适合骨软骨支架的SB部分。
基于生物陶瓷的ME打印技术主要用于骨软骨支架的CCZ和SB部分[]。 一般来说，生物陶瓷打印支架可实现的孔隙率较低（20%-60%），因此基于生物陶瓷材料制造高孔隙率支架非常困难。 同时，孔径也很小（0.1-0.4 mm），许多支架无法产生>0.3 mm的孔径，难以促进SB[-]中的骨生长。 虽然该技术被广泛用于构建骨软骨支架的 CCZ 和 SB 部分，但其低孔隙率和小孔径不利于组织生长。
3D打印水凝胶支架已广泛应用于关节骨软骨复合组织工程，尤其是AC部分的打印，而其多相支架的连续打印目前应用较少。 因此，具有完整连续性的天然关节骨软骨单元的仿生连续挤压技术可能是水凝胶3D打印未来的发展方向。 等[]用链状图案的水凝胶3D打印骨软骨支架的AC部分，再通过浇铸获得CCZ，从而获得具有边界层结构的连续骨软骨支架。 虽然水凝胶 ME 打印技术通常用于骨软骨支架的 AC 部分，但 GAO 等人。 []完全采用基于水凝胶ME的3D打印技术制作双相骨软骨支架，并将其添加到SB部分的水凝胶中。 β-磷酸三钙（β-，β-TCP）增加了水凝胶的机械刚度和骨诱导特性，同时转化生长因子-β1（TGF-β1）包含在 AC 部分中以增强软骨形成和分化。
2.2 融合电写和静电纺丝技术
熔化电写 (MEW) 和静电纺丝 (ES) 技术允许细丝通过喷嘴逐层沉积[]。 它的纤维直径从微米到纳米不等，实际上MEW通常生产超细纤维而ES通常生产纳米纤维。 此外，ES 是一种基于溶剂的印刷技术，可将材料纤维随机沉积在收集床上，而 MEW 是一种无溶剂方法，可以控制纤维沉积的位置和方式，从而控制最终图案。 对于 MEW 和 ES 技术，材料的选择是根据其电流体动力学原理的材料可加工性来确定的。 聚己内酯（PCL）是MEW最常用的材料，它还包括明胶、壳聚糖、聚乙烯醇（PVA）、透明质酸和胶原蛋白。 尽管 ES 中使用的材料有所增加，但所使用的溶剂通常具有生物毒性，并且可能会留下令人担忧的有毒残留物 []。
将 MEW 和 ES 应用于关节骨软骨支架的构建时，主要的挑战是 Z 轴打印结构的总厚度有限 []。 目前克服这一限制的方法是将材料打印到各种收集器和主体床上，以增加 Z 轴上的结构高度 []。 另一方面，鉴于生产的微/纳米纤维的高度和强度有限，MEW 和 ES 通常会产生更软的支架，非常适合关节骨软骨支架的 AC 部分。
CUI等[]应用ES制作了结构完整、厚度为2~3 mm的单相骨软骨支架。 虽然这个厚度足以填补大鼠模型的关节骨软骨缺损，但很难用于人类关节骨软骨缺损。 将这种技术与其他制造方法（多层构建）结合使用，打印到非平面收集器床或堆叠支架上，可以将高度增加到 6-15 毫米，用于人类骨软骨缺损修复 []。
2.3 光固化及数字光处理技术
立体光刻 (SLA) 和数字光处理 (DLP) 技术通过逐层沉积材料实现 3D 打印。 然而，这些技术都不是基于喷嘴的。 取而代之的是，液体材料位于树脂浴中，在那里构建板被降低，光源遵循编程模式，仅交联部分设计。 该过程允许材料逐层沉积，直到形成物体。
SLA 和 DLP 技术的区别在于所使用的光源。 SLA 使用激光，而 DLP 使用来自投影的光源[]。 SLA/DLP常规打印精度可达50μm，介于MEW/ES和ME[]之间。 这些技术采用与上述许多基础材料兼容的基础材料，但通常需要对材料进行大量修改 []。 目前用于关节骨软骨支架的材料包括聚乙二醇（PEG）、明胶甲基丙烯酰氯（GelMA）和磷酸三钙（TCP），它们可以结合光引发剂、光吸收剂、溶剂和/或分散剂的任何成分混合 [, ]。 在脚手架制造中，SLA 和 DLP 打印技术不像 ME 那样广泛使用，这可能是由于这些系统的前期投资和维护成本高。
到目前为止，与其他技术相比，SLA 和 DLP 打印支架没有孔隙率优势（50%-65%）[]。 这种技术可用于构建多层骨软骨支架。 例如，朱等人。 []利用DLP技术，以PEG材料结合天然牛软骨细胞外基质，打造多层骨软骨支架。
3 多层骨软骨支架结构
关节骨软骨复合组织工程支架的设计可分为单相、两相、三相或多相。 从理论上讲，单相或双层支架很难再现每个组织的特定特性，而多相支架可以通过协同每种材料、生物和机械组件性质的不同组合来再现三种组织中的至少两种. 构建含CCZ的关节骨软骨仿生支架需要增加相数，增加了制作难度，如何在体内保持其层间连接的稳定性也是一个很大的挑战。
3.1 单层或双层骨软骨支架
单相支架设计用于使用均质材料或复合材料修复整个关节骨软骨缺损。 这需要支架能够满足其中每个组织域的结构和功能要求，并具有单一的孔隙率和机械性能。 然而，使用单相支架修复关节骨软骨缺损的不同组织结构和功能是非常具有挑战性的。 目前已有一系列材料和生物制造技术构建单相支架的研究报道，包括基于氧化锌-PCL复合材料的ES和基于生物陶瓷的ME[-]。 其中，对材料溶液的浓度或其表面特性进行了优化和修饰，以增强细胞的软骨形成或成骨分化潜能，但单相支架很难同时实现这两种功能。
双相支架通常有软骨相和骨相，而它们之间的 CCZ 被忽略。 与单层支架相比，双层支架更接近天然的骨软骨组织。 双层支架分开构建，给研究者更大的发挥空间，可以控制和优化其材料、设计、孔隙率、力学功能和/或单元类型等，构建关节骨软骨的组织结构和功能，仿生学，并为促进其多个新组织的形成提供了更大的可能性。 例如，等人 [] 对脱细胞陶瓷“水泥”和基于细胞的藻酸盐水凝胶的各种双相组合进行了实验，以解决 CCZ 材料问题。
3.2 三层及以上的骨软骨支架
在开发三层或更多层关节骨软骨支架的过程中，CCZ 是一个需要考虑的层次结构，包括其材料的构建方式和使用的细胞类型。 目前一般采用两种材料构建方法，一种是完全独立于软骨相的材料构建方法，如poly(-co-acid)[poly(-co-acid), PLGA], TCP, (藻酸盐）和GelMA等； 另一种是使用软骨相材料或在软骨相材料的基础上添加其他材料来提高刚性和支撑，如甲基丙烯酸透明质酸或丙烯酸异辛酯改性β-环糊精[]，或在钠离子中加入介孔生物活性玻璃藻酸盐[]。
多层结构关节骨软骨支架的设计最为复杂，支架中至少有4个不同的层。 虽然这种构造方法尚未广泛使用，但从三相增加到四相或更多通常会将 AC 部分分解为不同的区域。 []提出了一种由4层不同结构组成的骨软骨支架，其目的是为了更好地模仿AC不同区域的特性，即从上到下不同的（胶原）排列结构等； 该PCL支架以0°、90°交叉排列模式为基础，孔隙率逐渐减小直至纹理致密，充当类似于CCZ的界面区； 然后，PCL继续沿着含有间充质干细胞（cells, MSCs）的水凝胶保持70%的孔隙率扩展为第3层，第4层去除PCL，只留下水凝胶和MSCs，再次使用相同的水凝胶，但使用关节软骨祖细胞(ACPC) 而不是 MSCs[]。 不难看出，这个结构非常复杂，需要更成熟的3D打印技术才能方便地实现。
4 未来趋势与展望
构建具有边界层结构的异质多层支架是未来关节骨软骨复合组织工程发展的主流方向。 近年来，随着增材制造3D打印技术的不断进步，界面层结构的关节骨软骨支架的构建变得更加方便和可行。 展望未来，基于3D打印技术的关节骨软骨支架的设计与制造在以下几个方面仍存在机遇与挑战。
4.1 边界层结构深入研究
骨软骨复合组织工程策略在治疗关节骨软骨缺损方面已经研究了十多年。 支架从简单的单层支架到多层支架构建，以更好地模拟自然关节骨软骨单元的组织。 结构。 但其三层脚手架结构复杂，将三种不同的结构铸成一个整体结构难度较大。 在增材制造技术出现之前，已经有很多关于界面层结构关节骨软骨支架构建的报道，如分层构建后层间交联[, ]； 或通过无缝过渡技术模仿天然CCZ界面，打造结构连续的关节骨软骨支架； Ru等[]通过冷冻干燥矿化和非矿化I型胶原蛋白糖胺聚糖悬浮液，设计制备了含有CCZ界面的关节骨软骨支架； ZHAI et al [ ] 采用“两次冷冻干燥”技术构建了高浓度壳聚糖/明胶溶液的致密隔离层。 然而，研究人员面临一个难题——天然关节骨软骨组织单元的最佳仿生构造！
CCZ作为关节软骨与软骨下骨的边界层结构，与相邻软骨之间的连接精密复杂，成分过渡自然，具有机械传递、应力吸收与转换、生理屏障等功能和作用。 由于其成分组成、形态特征、生理功能等最基本的科学问题尚未完全阐明，因此出现了“直接过渡”、“间接连接”等多种材料的骨软骨支架构建方案。 脚手架施工没有统一的黄金标准。 因此，只有深入分析关节骨软骨组织单元及其边界层结构的基础科学问题，才能为带边界层的关节骨软骨复合组织支架的3D打印制造指明道路和方向。结构。
4.2 生物3D打印技术的改进
许多现有的3D打印技术可用于关节骨软骨支架的制备，但每种技术都有其自身的优点和局限性，以及适合的打印材料。 在材料选择方面，到目前为止，没有证据表明一种材料一定比另一种材料好。 一般来说，水凝胶多用于打印AC； 生物陶瓷、透明质酸、TCP、金属材料[]更适合打印SB； 而开发具有更好生物相容性、可塑性和可改性性的新材料，也是未来亟待解决的问题之一。
在各种3D打印技术解决方案中，ME由于具有广泛的可用性、材料通用性和低成本等优点，是最常用的。 MEW和ES也经常被选择，但主要针对软骨相，可实现的支架厚度有限，这种所谓的“不足”使其适合制作薄而致密的界面结构，但其技术潜力仍然有限。 需要进一步发展。 由于CCZ与相邻结构之间的精细连接赋予了整个关节骨软骨单元良好的力学性能，为了实现其最大的仿生性，模仿这种连接也应作为重点方向考虑。 因此，更高精度的生物3D打印技术应该是未来需要攻克的难题。
4.3 支架结构促进组织生长
3D打印技术可以构建关节骨软骨细胞细胞外基质的仿生支架，为种子细胞的粘附、增殖和分化提供必要的空间，最终在体内继续发挥生物学功能。 为了使细胞在支架内生长良好，控制支架的设计参数，如孔径、孔隙率、表面拓扑结构等至关重要。将细胞植入支架的时机主要有两种选择。 一种是直接在打印材料中添加细胞，另一种是不添加细胞只打印支架。 这两种选择的优缺点目前还没有定论。 总之，不同研究中添加的细胞数量和种类不尽相同，甚至同一研究中不同支架层添加的细胞也不一定相同。
作为组织工程的种子细胞，需要适宜的生长环境和土壤肥料（生长因子）。 在生长环境方面，包括如何控制含氧量、选择培养基类型[]、需要什么样的物理刺激，如机械刺激、磁场等，都没有统一的金标准； 在生长因子方面，促进软骨形成和骨形成的生长的因素有很多种。 如何调整支架层间添加生长因子的时间、类型和比例，使种子细胞向所需方向分化，也面临着巨大的挑战。
4.4 走向临床转化应用
实现最新研发技术的临床转化应用，安全有效地解决患者的痛苦，是一项技术和一项基础研究的最终目标。 然而，每项研发技术从实验室到临床的路径都很漫长，制度和规范要求严格，资金和人力成本高。 遗憾的是，目前尚无利用3D打印技术修复关节骨软骨缺损的骨软骨支架的临床试验应用，少数组织工程骨软骨支架的临床试验应用是采用非3D打印技术制造的。 与其他组织工程解决方案相比，3D打印技术的个性化定制能力最具吸引力。 通常，关节骨软骨缺损的形状不规则，采用其他支架制造技术构建圆柱形和长方体支架相对容易，但形状不规则的支架难以构建。 这种“千篇一律”的支架很难与患者的缺陷相匹配。 无论是临时修复支架以贴合缺损，还是扩大患者病变范围以贴合支架，都不是最佳选择。 另一方面，3D打印技术可以根据患者病灶的MRI和CT扫描数据，预先构建出与缺损几何形状相匹配的托槽，甚至可以针对患者不同的缺损部位定制不同的个性化托槽。 . 此外，基于这些数据，还可以利用3D打印技术制作虚拟模型，在体外模拟手术，从而提高手术治疗效果，减轻患者痛苦。
总之，随着3D打印技术的发展和进步，对关节骨软骨界面结构研究的深入，以及科研人员和医护人员的通力合作，上述困难和问题必将得到克服。 3D打印技术构建具有边界层结构的关节骨软骨仿生支架的不断拓展和应用，必将提高各种损伤引起的关节骨软骨缺损的再生治疗水平，最终造福于广大骨关节损伤患者。